造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性的群體，具有長(zhǎng)期自我更新的能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能。它是研究歷史*長(zhǎng)且*為深入的一類成體干細(xì)胞，對(duì)研究各類干細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，具有重要指導(dǎo)意義。血液系統(tǒng)中的成熟細(xì)胞壽命極短，因此在人的一生中，造血干細(xì)胞需要根據(jù)機(jī)體的生理需求適時(shí)的補(bǔ)充血液系統(tǒng)各個(gè)成熟細(xì)胞組分。同時(shí)在損傷、炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下，造血干細(xì)胞也扮演著調(diào)節(jié)和維持體內(nèi)血液系統(tǒng)各個(gè)細(xì)胞組分的生理平衡的角色。在對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)程運(yùn)輸和儲(chǔ)存時(shí)，為保持細(xì)胞的活性，需要對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行凍存，現(xiàn)有的凍存方法容易對(duì)細(xì)胞造成一定損傷，不利于造血干細(xì)胞的儲(chǔ)存，為此，提出一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法，包括如下步驟：

S1、細(xì)胞凍存液配制：以質(zhì)量百分含量計(jì)，30～40％人血白蛋白，二甲基亞砜5～15％，羥乙基淀粉占3～6％，余量為無(wú)血清培養(yǎng)基，配好的冷存液放在1～8℃的溫度條件下低溫冷藏；

S2、容器消毒：用消毒液對(duì)存放干細(xì)胞的容器表面進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線進(jìn)行**照射，照射時(shí)長(zhǎng)5～10分鐘；

S3、干細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)，保證干細(xì)胞**可靠；

S4、干細(xì)胞處理：將干細(xì)胞分成多組放置在經(jīng)S2消毒后的不同容器內(nèi)，并將盛有干細(xì)胞的容器放置在1～15℃的無(wú)菌環(huán)境內(nèi)存放30～50分鐘；

S5、干細(xì)胞篩選處理：將S4處理后的干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，然后通過(guò)顯微鏡觀察干細(xì)胞活躍性，挑選出活躍性*強(qiáng)的一組；

S6、凍存：將S5挑選出的干細(xì)胞在0～10℃的低溫環(huán)境下，將干細(xì)胞和凍存液加入新的容器中，然后將凍存容器放入程序降溫裝置，先在2～8℃的溫度條件下低溫冷藏1～2小時(shí)，再在-10～-40℃的溫度條件下冷凍12～24小時(shí)，再在-40～-80℃的溫度條件下冷凍12～24小時(shí)，然后將凍存容器放置在液氮中冷凍；

S7、干細(xì)胞復(fù)蘇：將S6中干細(xì)胞從液氮中取出，將取出的凍存容器放置在5～15℃無(wú)菌環(huán)境下解凍3～5小時(shí)，然后再浸入在溫度為37℃的無(wú)菌溫水環(huán)境中進(jìn)行解凍2～4小時(shí)，并進(jìn)行勻速搖擺晃動(dòng)使其融化復(fù)蘇。

**的，所述S2中消毒液為純度為70～75％的酒精。

**的，所述S2中紫外線照射環(huán)境相對(duì)濕度為50～60％、溫度為15～20℃，紫外線強(qiáng)度不得低于70uW/cm2。

   與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出的方法通過(guò)對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行溫度梯度凍存與復(fù)蘇，防止造血干細(xì)胞因溫度驟降而受到損傷，從而避免了因溫度驟降使細(xì)胞內(nèi)外水形成冰晶和細(xì)胞變形對(duì)細(xì)胞造成損害，該方法能夠提高造血干細(xì)胞的凍存活性，減少造血干細(xì)胞的損失。

具體實(shí)施方式

   為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法，包括如下步驟：

S1、細(xì)胞凍存液配制：以質(zhì)量百分含量計(jì)，30～40％人血白蛋白，二甲基亞砜5～15％，羥乙基淀粉占3～6％，余量為無(wú)血清培養(yǎng)基，配好的冷存液放在1～8℃的溫度條件下低溫冷藏；

S2、容器消毒：用消毒液對(duì)存放干細(xì)胞的容器表面進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線進(jìn)行**照射，照射時(shí)長(zhǎng)5～10分鐘，消毒液為純度為70～75％的酒精，紫外線照射環(huán)境相對(duì)濕度為50～60％、溫度為15～20℃，紫外線強(qiáng)度不得低于70uW/cm2；

S3、干細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)，保證干細(xì)胞**可靠；

S4、干細(xì)胞處理：將干細(xì)胞分成多組放置在經(jīng)S2消毒后的不同容器內(nèi)，并將盛有干細(xì)胞的容器放置在1～15℃的無(wú)菌環(huán)境內(nèi)存放30～50分鐘；

S5、干細(xì)胞篩選處理：將S4處理后的干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，然后通過(guò)顯微鏡觀察干細(xì)胞活躍性，挑選出活躍性*強(qiáng)的一組；

S6、凍存：將S5挑選出的干細(xì)胞在0～10℃的低溫環(huán)境下，將干細(xì)胞和凍存液加入新的容器中，然后將凍存容器放入程序降溫裝置，先在2～8℃的溫度條件下低溫冷藏1～2小時(shí)，再在-20～-100℃的溫度條件下冷凍12～24小時(shí)，再在-110～-140℃的溫度條件下冷凍12～24小時(shí)，然后將凍存容器放置在液氮中冷凍；

S7、干細(xì)胞復(fù)蘇：將S6中干細(xì)胞從液氮中取出，將取出的凍存容器放置在5～15℃無(wú)菌環(huán)境下解凍3～5小時(shí)，然后再浸入在溫度為37℃的無(wú)菌溫水環(huán)境中進(jìn)行解凍2～4小時(shí)，并進(jìn)行勻速搖擺晃動(dòng)使其融化復(fù)蘇。

實(shí)施例1

一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法，包括如下步驟：

S1、細(xì)胞凍存液配制：以質(zhì)量百分含量計(jì)，30％人血白蛋白，二甲基亞砜5％，羥乙基淀粉占3％，余量為無(wú)血清培養(yǎng)基，配好的冷存液放在1℃的溫度條件下低溫冷藏；

S2、容器消毒：用消毒液對(duì)存放干細(xì)胞的容器表面進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線進(jìn)行**照射，照射時(shí)長(zhǎng)5分鐘，消毒液為純度為70％的酒精，紫外線照射環(huán)境相對(duì)濕度為50％、溫度為15℃，紫外線強(qiáng)度不得低于70uW/cm2；

S3、干細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)，保證干細(xì)胞**可靠；

S4、干細(xì)胞處理：將干細(xì)胞分成多組放置在經(jīng)S2消毒后的不同容器內(nèi)，并將盛有干細(xì)胞的容器放置在1℃的無(wú)菌環(huán)境內(nèi)存放30分鐘；

S5、干細(xì)胞篩選處理：將S4處理后的干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，然后通過(guò)顯微鏡觀察干細(xì)胞活躍性，挑選出活躍性*強(qiáng)的一組；

S6、凍存：將S5挑選出的干細(xì)胞在0℃的低溫環(huán)境下，將干細(xì)胞和凍存液加入新的容器中，然后將凍存容器放入程序降溫裝置，先在2℃的溫度條件下低溫冷藏1小時(shí)，再在-20℃的溫度條件下冷凍12小時(shí)，再在-110℃的溫度條件下冷凍12小時(shí)，然后將凍存容器放置在液氮中冷凍；

S7、干細(xì)胞復(fù)蘇：將S6中干細(xì)胞從液氮中取出，將取出的凍存容器放置在5℃無(wú)菌環(huán)境下解凍3小時(shí)，然后再浸入在溫度為37℃的無(wú)菌溫水環(huán)境中進(jìn)行解凍2小時(shí)，并進(jìn)行勻速搖擺晃動(dòng)使其融化復(fù)蘇。

實(shí)施例2

一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法，包括如下步驟：

S1、細(xì)胞凍存液配制：以質(zhì)量百分含量計(jì)，40％人血白蛋白，二甲基亞砜15％，羥乙基淀粉占6％，余量為無(wú)血清培養(yǎng)基，配好的冷存液放在8℃的溫度條件下低溫冷藏；

S2、容器消毒：用消毒液對(duì)存放干細(xì)胞的容器表面進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線進(jìn)行**照射，照射時(shí)長(zhǎng)10分鐘，消毒液為純度為75％的酒精，紫外線照射環(huán)境相對(duì)濕度為60％、溫度為20℃，紫外線強(qiáng)度不得低于70uW/cm2；

S3、干細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)，保證干細(xì)胞**可靠；

S4、干細(xì)胞處理：將干細(xì)胞分成多組放置在經(jīng)S2消毒后的不同容器內(nèi)，并將盛有干細(xì)胞的容器放置在15℃的無(wú)菌環(huán)境內(nèi)存放50分鐘；

S5、干細(xì)胞篩選處理：將S4處理后的干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，然后通過(guò)顯微鏡觀察干細(xì)胞活躍性，挑選出活躍性*強(qiáng)的一組；

S6、凍存：將S5挑選出的干細(xì)胞在10℃的低溫環(huán)境下，將干細(xì)胞和凍存液加入新的容器中，然后將凍存容器放入程序降溫裝置，先在8℃的溫度條件下低溫冷藏2小時(shí)，再在-100℃的溫度條件下冷凍24小時(shí)，再在-140℃的溫度條件下冷凍24小時(shí)，然后將凍存容器放置在液氮中冷凍；

S7、干細(xì)胞復(fù)蘇：將S6中干細(xì)胞從液氮中取出，將取出的凍存容器放置在15℃無(wú)菌環(huán)境下解凍5小時(shí)，然后再浸入在溫度為37℃的無(wú)菌溫水環(huán)境中進(jìn)行解凍4小時(shí)，并進(jìn)行勻速搖擺晃動(dòng)使其融化復(fù)蘇。

實(shí)施例3

一種干細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法，包括如下步驟：

S1、細(xì)胞凍存液配制：以質(zhì)量百分含量計(jì)，32％人血白蛋白，二甲基亞砜7％，羥乙基淀粉占5％，余量為無(wú)血清培養(yǎng)基，配好的冷存液放在5℃的溫度條件下低溫冷藏；

S2、容器消毒：用消毒液對(duì)存放干細(xì)胞的容器表面進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線進(jìn)行**照射，照射時(shí)長(zhǎng)6分鐘，消毒液為純度為76％的酒精，紫外線照射環(huán)境相對(duì)濕度為56％、溫度為16℃，紫外線強(qiáng)度不得低于70uW/cm2；

S3、干細(xì)胞檢測(cè)：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒檢測(cè)，保證干細(xì)胞**可靠；

S4、干細(xì)胞處理：將干細(xì)胞分成多組放置在經(jīng)S2消毒后的不同容器內(nèi)，并將盛有干細(xì)胞的容器放置在11℃的無(wú)菌環(huán)境內(nèi)存放32分鐘；

S5、干細(xì)胞篩選處理：將S4處理后的干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，去除上清液，然后通過(guò)顯微鏡觀察干細(xì)胞活躍性，挑選出活躍性*強(qiáng)的一組；

S6、凍存：將S5挑選出的干細(xì)胞在3℃的低溫環(huán)境下，將干細(xì)胞和凍存液加入新的容器中，然后將凍存容器放入程序降溫裝置，先在3℃的溫度條件下低溫冷藏1.5小時(shí)，再在-21℃的溫度條件下冷凍13小時(shí)，再在-111℃的溫度條件下冷凍13小時(shí)，然后將凍存容器放置在液氮中冷凍；

S7、干細(xì)胞復(fù)蘇：將S6中干細(xì)胞從液氮中取出，將取出的凍存容器放置在6℃無(wú)菌環(huán)境下解凍4小時(shí)，然后再浸入在溫度為37℃的無(wú)菌溫水環(huán)境中進(jìn)行解凍3小時(shí)，并進(jìn)行勻速搖擺晃動(dòng)使其融化復(fù)蘇。